Produção, concentração e caracterização parcial de extrato celulolítico produzido por linhagem fúngica mutante.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ. Orientadora Embrapa Agroenergia: Mônica Caramez Triches Damaso

Clavulanic acid and cephamicin c: a perspective of the biosynthesis, isolation and action mechanism

The present article reviews different aspects of the chemistry of two widely used β-lactam antibiotics Clavulanic Acid and Cephamycin C. The article discusses important details of the biosynthesis of these compounds, their action mechanism and, principally, the methods employed in their isolation and purification, in accordance with the available literature. Despite the large quantity of available articles and patents concerning β-lactam antibiotics, those which describe the isolation and purification of Clavulanic Acid and Cephamycin C are rare. Overall, the intention of this article is to discuss the up-to-date scientific research related to the compounds under review.FAPESPCNPqCoordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES

Clonagem e expressão heteróloga do gene pgk de Brucella abortus.

Trabalho 1

Clonagem e caracterização de sistemas de restrição e modificação do tipo IIG de Epsilonproteobacteria em Escherichia coli

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Os sistemas de restrição e modificação (RM) são sistemas enzimáticos não vitais, de complexidade variável, ubiquitários em Bacteria e Archaea. Actualmente considera-se que existam quatro grandes tipos e vários subtipos. Alguns dos géneros que pertencem à ordem Campylobacterales, nomeadamente Helicobacter e Campylobacter, têm uma característica pouco frequente, a presença de um elevado número de sistemas RM putativos no seu genoma. Analisaram-se os trinta e um genomas completamente sequenciados pertencentes à espécie H. pylori e os nove genomas completamente sequenciados pertencentes à espécie C. jejuni, anotados na REBASE (restriction enzyme database), e verificou-se que os sistemas RM não se encontram distribuídos ao acaso pelo genoma, localizando-se em loci bem definidos. A análise focou-se nos sistemas RM do tipo IIG e tendo as estirpes H. pylori 26695 e C. jejuni RM1221 como modelo, encontraram-se quatro loci em cada uma delas. Foram desenhados primers para os oito loci e usadas dezassete estirpes de H. pylori e cento e sessenta e nove estirpes de Campylobacter para verificar se essa observação era comum entre as diferentes estirpes. Obteve-se amplificação em todos os loci testados mas observaram-se grandes diferenças entre eles, após digestão com HindIII. Pôde também observar-se que nalguns dos loci testados não se obteve amplificação. Todos os produtos de PCR cujo perfil foi diferente, quer de estirpes de H. pylori, quer de estirpes de Campylobacter, foram clonados em pUC19 e transformados em Escherichia coli DH10B, mas apenas sete dos produtos de Campylobacter codificaram para uma enzima de restrição activa. É possível que em H. pylori a maioria destes genes putativos esteja inactivo, não só porque nos genomas sequenciados existem várias ORF com frameshifts, mas também porque podem ter ocorrido movimentos de sequências de DNA entre domínios situados em posições diferentes, no interior de um gene. No futuro, a sequenciação dos clones obtidos poderá permitir perceber se essa é de facto a razão para a falta de actividade observada.Restriction and modification (RM) systems are non-vital enzymatic systems of diverse complexity, which are ubiquitary among Bacteria and Archaea. Currently the RM systems are classified into four major types and several subtypes. Some of the genus which belong to order Campylobacterales, mainly Helicobacter and Campylobacter, have a remarkable characteristic, the presence of a large number of putative RM systems in their genomes. The thirty one complete sequenced H. pylori genomes were analysed as well as the nine complete sequenced C. jejuni genomes annotated in REBASE (restriction enzyme database) and it was found that the RM systems are not randomly distributed over the genome, but instead are located at specific loci. The analysis was directed to type IIG RM systems and having H. pylori 26695 and C. jejuni RM1221 as models, four loci in each of them were found. Primers for the eight loci were designed and seventeen H. pylori strains and a hundred and sixty nine Campylobacter strains were used to test if this observation was common. PCR products were obtained in all loci but large differences between them were observed after digestion with HindIII. It was also realised that some of the loci were empty. All of the different PCR products from H. pylori strains and Campylobacter strains were cloned in pUC19 and transformed in Escherichia coli DH10B, but only seven from Campylobacter showed restriction activity. In H. pylori it is possible that most of these type IIG genes are “turn off” in the majority of the strains tested, not only because in the sequenced genomes there are several ORF with frameshifts, but also because movements of sequences between domains in different positions within a protein coding gene might have occurred . We will sequence some of our clones to see if that is the reason for the lack of activity

Utilização de lisinas de bacteriófagos no controlo de bactérias patogénicas gram-positivas

Tese de mestrado, Biologia (Microbiologia Aplicada), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasAs endolisinas ou, simplesmente, lisinas são hidrolases da parede celular bacteriana, sintetizadas na fase final do ciclo lítico de fagos de DNA de cadeia dupla, cuja acção permite a libertação da progenia viral. Diversos estudos recentes demonstraram que as lisinas quando aplicadas exogenamente a bactérias Gram-positivas, como proteínas recombinantes purificadas, têm a capacidade de degradar o peptidoglicano da parede celular, causando a lise rápida da célula bacteriana. Com este trabalho pretendeu-se inicialmente caracterizar, clonar e expressar lisinas activas contra Staphylococcus aureus e Propionibacterium acnes. Para aumentar a solubilidade destas enzimas produziram-se proteínas truncadas, contendo apenas o domínio catalítico e, lisinas quiméricas em que se conjugaram diferentes domínios catalíticos e motivos de ligação à parede celular de origem heteróloga. As lisinas que demonstraram melhor solubilidade e actividade lítica foram purificadas por cromatografia de afinidade. Estas foram uma lisina truncada (Lys161) contendo apenas o domínio de endopeptidase CHAP da lisina Lys87, especifica para S. aureus, e duas lisinas quiméricas (Lys168- 87 e Lys170-87) contendo, respectivamente, os domínios catalíticos endopeptidase CHAP e de Amidase-2 de lisinas de Enterococcus sp., fundidos ao domínio C-terminal de Lys87 que apresenta os motivos de ligação ao peptidoglicano. A avaliação da actividade lítica das lisinas em isolados bacterianos de meios hospitalares e da comunidade evidenciou um elevado potencial lítico das lisinas quiméricas em mais de 90% das estirpes de S. aureus testadas, incluindo uma elevada fracção destas com resistência à meticilina. Estas quimeras demonstraram também capacidade de lise em estirpes de Enterococcus spp., Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Micrococcus luteus e Bacillus spp. A lisina truncada Lys161, comparativamente, apresentou menor actividade lítica, com redução do espectro lítico. Os resultados obtidos demonstram o potencial das lisinas quiméricas produzidas na eliminação de bactérias patogénicas, incluindo estirpes de S. aureus resistentes à meticilina.Endolysins, or simply lysins, are bacterial cell wall hydrolysing enzymes that are produced at the end of the lytic cycle of double stranded DNA phages, to allow the release of viral progeny. Many recent studies have shown that when applied externally to Gram-positive bacteria, as purified recombinant proteins, lysins are capable of degrading the cell wall peptidoglycan, resulting in a rapid bacterial cell lyses. This study initially aimed the characterization, cloning and expression of lysins targeting Staphylococcus aureus and Propionibacterium acnes. To increase their solubility the enzymes were produced in the form of truncated proteins, which exclusively carried the catalytic domain, and chimerical polypeptides where different catalytic and cell wall binding domains of heterologous origin were fused. The lysins that exhibited higher solubility and lytic activity were purified by affinity chromatography. Specifically, these were a truncated derivative of Lys87 (Lys161), containing only a CHAP peptidase domain acting on S. aureus, and two chimerical lysins (Lys168-87 and Lys170-87) comprising, respectively, the functional CHAP peptidase and amidase-2 domains of Enterococcus sp. lysins fused to the cell wall targeting domain of the S. aureus lysin Lys87. The evaluation of lysin bacteriolytic activity on bacterial clinical isolates from hospital and community samples showed a high lytic potential of chimerical lysins, which were able to lyse more than 90% of the tested S. aureus strains, including a high fraction of methicillin-resistant isolates. These chimeras also displayed lytic activity against strains of Enterococcus spp., Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Micrococcus luteus and Bacillus spp. Truncated lysin Lys161 showed less lytic activity and a narrow spectrum when compared to the chimerical endolysins. Our results demonstrate the potential of chimerical lysins to eliminate pathogenic bacteria, including methicillin-resistant S. aureus strains

Técnicas em biologia molecular.

bitstream/item/58217/1/doc116.pd

Biodiesel: a critical overview on the current status and perspectives at the academy and industry

This article presents a bibliographic review of research carried out on different alternative processes for biodiesel production. The supercritical and subcritical (non catalytic) reaction conditions, the use of solid basic, solid acid and other heterogeneous catalysts, including the use of immobilized enzymes and whole-cell catalysts are also critically compared with the traditional homogeneous alkaline or acid catalysts that are common on industrial applications. Advantages and limitations of all these processes for the transference from the laboratory to the industry are discussed. A correlation of the chemical composition with the quality parameters of the produced biodiesel is done with aim to stablish adequate procedures for the right selection of the raw-material. Castor bean oil is used as an example of inappropriate oil in order to produce a B100 that fulfill all the international physico-chemical quality standards. In this article are presented research results to adequate the values of viscosity, density and iodine number of the castor and soybean biodiesel to the international standard limits by means blending these both biodiesels at the right ratio

Recuperação e purificação de enzimas usando adsorção em leito expandido

Orientadores: Telma Teixeira Franco, Reginaldo GuirardelloTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia QuimicaResumo: O presente trabalho refere-se ao uso da técnica de adsorção em lejto expandido para recuperar e purificar enzimas. Aspectos fundamentais da adsorção em leito expandido são abordados, utilizando lisozima e soro albumina bovina como proteínas modelo, e as enzimas, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisae, xilanase (extrato comercial) e quitosanase produzida por Bacil/us cereus. A avaliação da influência do uso de dois distribuidores, poroso e do tipo prato perfurado, mostrou que o distribuidor do tipo prato perfurado favoreceu mais à adsorção em leito expandido e que os adsorventes Streamline@ SP e Streamline@ DEAE possuem uma ampla distribuição de tamanho de partículas favorecendo ao fenômeno de segregação (Capítulo 2 - Artigo publicado no IEX 2000 (Cambridge/UK)). O uso de um processo integrado para recuperar e purificar a enzima intracelular Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase mostrou-se bem sucedido. O desempenho hidrodinâmico e cromatográfico foi estudado usando um adsorvente de estrutura pelicular (Pellicular) e dois adsorventes porosos comerciais (Stream1ine e Macrosorb) . Os resultados mostraram que o adsorvente Pellicular apresentou as melhores propriedades hidrodinâmicas e cromatográficas. (Capítulo 3 - Artigo em parceria e que será submetido à periódico internacional). O estudo da influência do uso de uma altura do leito empacotado, de 0,050 m e de 0,075 m na ALE operando-se em 10% da curva de ruptura, mostrou que uma altura de 0,075 m foi mais eficiente. Para o sistema lisozima - Streamline@ DEAE o rendimento aumentou com o aumento da velocidade linear enquanto que para o sistema BSA - Streamline@ SP esse fato não foi observado. Neste caso, para o sistema BSA - Streamline@ SP, a transferência de massa parece ser limitada pela menor densidade de carga acarretando assim em menores valores de eficiência em 10% de ruptura. (Capítulo 4 - Artigo aceito para publicação no periódico Biosepara_ion). O estudo da influência do conteúdo de células na adsorção em leito expandido mostrou que quando foi utilizado o extrato com o conteúdo de 5% de células (peso úmido), em leito expandido, o desempenho da purificação foi comprometido. (Capítulo 5 - Artigo aceito para publicação no periódico Joumal of Chromatography A). A adsorção de quitosanase de um caldo de fermentação de Baci/lus cereus em leito empacotado permitiu à obtenção de um pico com um fator de purificação de 7,6 e uma recuperação de 67,4% que eluiu com 0,51 M de NaCL Valores muito próximos a estes foram obtidos com o uso da adsorção em leito expandido com ambos os caldos, bruto e clarificado. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS­P AGE) realizada para o tubo que exibiu a maior atividade, quando o leito foi no modo expandido e com células, mostrou a presença de duas bandas. Este fato sugere três possibilidades, a existência de duas quitosanases, a presença de um proteína contaminante ou a existência de uma quitosanase com duas sub-unidades (dímera). Entretanto, grande parte dos contaminantes foram separados da quitosanase em uma única etapa. (Capítulo 6 - Artigo que será submetido à um periódico internacional)Abstract: This work deals with the application of Expanded Bed Adsorption (EBA) to recovery and purify enzymes. Model proteins, lisozyme and bovine serum albumin (BSA), as well as some enzymes, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) from baker's yeast, xylanase (from a commercial extract) and chitosanase from Bacil/us cereus were used to study the EBA background and application. The influence of two distributor (porous and perfurated plate) showed that the perfurated plate distributor was more favorable for the EBA. The Strearnline@ SP and the Strearnline@ DEAE adsorbents have a wide size distribution favourable for the segregation phenomena. (Chapter 2 - artic1e published in IEX 2000 (Carnbridge/UK». An integrated process was successful to recover and to purify an intracellular enzyme, Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase (G3PDH). Performance of the hydrodynamic and chromatographic properties using a pellicular adsorbent (Pellicular) and two porous commercial adsorbents (Stream1ine and Macrosorb) showed that the former presented the best hydrodynarnic and chromatographic properties. (Chapter 3 - paper that wiil be submmited to an international journal). The influence of two settled bed height, 0.050 m and 0.075m, respectively, in the EBA operating at 10% of the breaktrough curve, showed that the former was more efficient. For the lisozyme - Strearnline@ DEAE system yield increased with the increase of the velocity while for the BSA - Strearnline@ SP system this behaviour was not observed. In this case, mass transfer seems to be limited problably due to its lower charge density. (Chapter 4 - paper accepted for publication in the Bioseparation Journal). The influence of cell contents in the EBA using a 5% (wet weight) cell content showed that the purification perfonnance was hampered. (Chapter 5 ­paper accepted for publication in the Journal ofChromatography A). The chitosanase adsorption of fermentation broth from Bacillus cereus, in packed mode, showed a chitosanase peak that eluted with 0.51 M NaCl, in this case a 7.6-fold purification factor with 67.4% of activity recovery were obtained. Similar values were obtained for both c1arified and unc1arified fermentation broth using the bed in the expanded mode. Experiment in expanded mode showed that two bands were present in the peak showing the highest activity, this suggests three possibilities, the existence of two chitosanases, the existence of a contaminant protein or the existence of a chitosanase with two sub-units. However, it was possible to separate the chitosanase from the-main contaminants in just one step. (Chapter 6 - paper that will be submitted to an international journal)DoutoradoDesenvolvimento de Processos QuímicosDoutor em Engenharia Químic